Padi Hibrida Cina, Hasil Rekayasa Genetika

REKAYASA GENETIKA

Padi Hibrida Cina, Buah dari Ketekunan dan Kesabaran Sebuah Penelitian

POSTED 10 AGUSTUS 2012

http://biogen.litbang.deptan.go.id/index.php/2012/08/padi-hibrida-cina-buah-dari-ketekunan-dan-kesabaran-sebuah-penelitian/

 

Siapakah yang tidak mengenal padi hibrida? Komoditas yang satu ini mulai dilirik para pengusaha karena harga benih yang menggiurkan. Satu kg benih padi biasa dihargai sekitar Rp 5000-6000/kg, sedangkan padi hibrida bisa mencapai Rp 45.000-50.000/kg. Siapa yang tidak tergiur dengan nilai jual yang begitu tinggi. Apalagi beras adalah makanan pokok utama rakyat Indonesia, sehingga petani pasti mencarinya. Benih yang tidak bisa ditanam lagi ini membuat para pengusaha berlomba-lomba membuat benih padi hibrida sendiri, membeli lisensi dari peneliti padi hibrida, atau hanya sebagai pengimpor murni. Oleh sebab itulah penelitian padi hibrida adalah tambang emas bagi dunia penelitian padi dan tentu saja bagi pengusaha. Namun, betulkah padi hibrida seindah yang dibayangkan?

Prinsip Padi Hibrida

Prinsip padi hibrida adalah memanfaatkan sifat heterosis (hybrid vigor) ketika dua tetua yang berbeda dikawinkan. Benih yang dihasilkan (F₁) ketika ditanam diharapkan akan memberikan hasil lebih baik dibandingkan dengan dua tetuanya. Prinsip inilah yang digunakan untuk memproduksi benih jagung hibrida. Ketika tetua jagung A dalam kondisi homozigot (didapatkan melalui perkawinan sendiri/selfing) disilangkan dengan tetua jagung B yang juga dalam kondisi homosigot, maka biji yang dihasilkannya adalah heterosigot yang ketika ditanam akan memberikan hasil (produksi) lebih baik dibandingkan dengan tetua A dan B. Persilangan buatan pada jagung jauh lebih mudah dibandingkan padi karena posisi bunga jantan dan betina terpisah di dalam satu pohon. Dalam skala industri bunga jantan yang tidak dikehendaki bisa dipotong menggunakan mesin. Namun, dengan adanya sifat mandul jantan pada jagung tetua A sebagai tetua betina tidak perlu dilakukan pemotongan bunga jantannya. Sederhana sekali. Bagaimanakah dengan padi? Tentu saja tidak bisa menggunakan prinsip kerja seperti pada jagung, sehingga mutlak diperlukan tetua A yang memiliki sifat mandul jantan, karena bunga padi sangat kecil dan banyak dan tidak mungkin dilakukan kastrasi (membuang benang sari) satu persatu.

Pada padi hibrida diperlukan 3 tetua, yakni tetua A sebagai galur yang punya sifat mandul jantan, sering disebut galur CMS (Cytoplasmic male sterility line) galur B (maintainer line) yang berfungsi sebagai tetua yang ketika disilangkan dengan tetua A bisa menghasilkan benih yang ketika ditanam tanamannya adalah mandul jantan juga. Tanpa tetua B benih-benih tetua A tidak mungkin bisa diproduksi. Tetua yang lain adalah tetua R (restorer), yakni tetua yang akan disilangkan dengan tetua A untuk menghasilkan benih F₁. Ketiga tetua inilah yang dipakai sebagai modal untuk menghasilkan benih F₁ yang bagus. Namun untuk mendapatkan 3 tetua tersebut tentu saja memerlukan waktu bertahun-tahun dan penelitian yang tidak mengenal lelah. Untuk memahami mekanisme kerja padi hibrida dapat dilihat dalam Tabel 1.

Tetua A dan B merupakan pasangan yang tidak terpisahkan dan harus cocok secara genetik. Tetua A atau galur CMS merupakan galur yang secara genetik membawa sifat mandul jantan ditandai dengan tidak adanya kemampuan menghasilkan polen yang fertil. Sifat ini di bawa oleh DNA faktor S (steril) yang terdapat pada sitoplasma, ketika berinteraksi dengan DNA pada inti sel (rr) yang juga steril maka ekspresi polen menjadi steril juga. Pada persilangan CMS (A) dan maintainer (B), yang dipakai sebagai induk betina adalah galur A dengan gen S pada sitoplasma. Polen yang digunakan dari galur B bersifat fertil, namun gen S pada mitokondria B tidak terikut pada persilangan A x B. Oleh karena itulah benih-benih yang dihasilkan dari persilangan A x B ketika ditanam akan steril. Galur A dan B ini harus dicari dengan cara mengeskplorasi plasma nutfah yang ada, baik dari varietas lokal/ introduksi, japonica/indica, varietas liar, dan sebagainya. Persilangan dengan jarak genetik yang berbeda biasanya bisa menghasilkan tanaman CMS. Untuk menghasilkan tanaman A dan B yang kembar biasanya dilakukan silang balik berkali-kali. Hal ini perlu dilakukan agar ketika dilakukan persilangan dengan restorer tidak banyak variasi genetik pada tanaman CMS. Tanaman CMS harus seragam secara genetik. Dengan persilangan silang balik berulang-ulang akan dihasilkan tanaman CMS dan maintainer yang susunan genetik pada gen inti sama kecuali gen S pada sitoplasma.

Tabel 1. Mekanisme kerja padi hibrida. Galur Fungsi Gen sitoplasma Gen inti Kondisi polen A CMS S (rr) Steril B Maintainer N (rr) Fertil A/B F1 CMS (=CMS) S (rr) Steril R Restorer N atau S     (RR) Fertil A/R F1 Hybrid S    (Rr) Fertil Kantor China National Hybrid Rice Research and Development.

Laboratorium

Galur restorer tidak sesulit mencari dan membuat galur A dan B, namun memerlukan pengujian persilangan berkali-kali. Begitu didapatkan beberapa galur A (beserta pasangannya), maka kandidat restorer disilangkan dengan galur A untuk dilihat fertilitas F₁-nya. Walaupun secara teori gen yang dikandung pada benih F₁ adalah S(Rr), tapi belum tentu tanaman F₁-nya akan menghasilkan benih dalam keadaan utuh. Setelah didapatkan calon-calon restorer yang cocok dilakukan persilangan untuk menghasilkan benih F₁. Benih F₁ ditanam dan diuji daya gabungnya (combining ability) dan harus dibandingkan pula dengan varietas yang sudah ada. Benih F₁ yang memiliki daya gabung tinggi, melebihi dari tetua standar diuji berkali-kali terhadap produksi, hama penyakit, kualitas beras/nasi, dan tentu saja diuji di beberapa lokasi untuk melihat potensi hasilnya.

Padi Hibrida Cina

Adalah Prof. Yuan Longping, seorang peneliti dari Cina dilahirkan di Beijing (Cina) pada tahun 1930 telah berhasil mengembangkan padi hibrida sedemikian rupa sehingga bisa berkembang pesat seperti sekarang ini. Dialah yang pertama kali mengemukakan ide penggunaan heterosis pada padi dan memulai penelitian padi hibrida di Cina pada tahun 1964 (umur 34 tahun). Langkah pertama yang dilakukan adalah mencari tetua A (mandul jantan) secara alami dan pasangannya (tetua B). Upaya ini terus dilakukan sampai tahun 1970 dan ditemukan beberapa pasang tetua padi yang bisa dijadikan sebagai tetua A dan B. Pada tahun 1973 beberapa galur dari IRRI didatangkan dijadikan sebagai tetua restorer, dan ternyata ada yang cocok. Galur/benih F₁ yang memberikan sifat superior ini dinamakan “Nan You No. 2” di mana mulai dikomersialkan di Cina pada tahun 1976. Terbukti padi hibrida pertama tersebut berhasil melebihi varietas komersial yang ada pada waktu itu. Penelitian padi hibrida Cina ini terus berlangsung sampai sekarang ini, dan karena dianggap penting maka didirikanlah pusat penelitian padi hibrida Cina, atau China National Hybrid Rice Research and Development pada tahun 1986, di mana Prof. Yuan Longping sebagai bapak padi hibrida Cina menjadi direktur sampai sekarang ini. Bahkan, pada usianya yang telah menginjak 92 tahun beliau masih sanggup menjadi nakhoda pusat penelitian padi hibrida Cina. Perlu diketahui instansi ini berada di bawah Minitry of Science and Technology (mirip Kementerian Riset dan Teknologi di Indonesia.

Perkembangan padi hibrida Cina bisa terbagi ke dalam beberapa tahap, yakni:

1.  Three lines system (periode 1960-1980).

2.  Two lines system (periode 1980-1995).

3.  Super hybrid rice (1996 sampai sekarang).

4.  One line system (baru tahap pengembangan).

Three lines system menggunakan tiga galur (A, B, dan R) dan sudah dijelaskan di atas. Produksi padi hibrida juga memerlukan kehati-hatian agar serbuk sari yang terpakai adalah benar-benar dari galur R, bukan dari tanaman padi lainnya. Oleh karena itulah kadang-kadang digunakan penghalang benda (plastik), penghalang tempat, penghalang waktu tanam, atau penghalang tanaman lain yang bisa menghalangi serbuk sari dari tanaman padi yang bukan yang dikehendaki. Perbandingan antara galur A dan R juga berbeda agar dihasilkan F₁ hibrid sebanyak-banyaknya. Biasanya galur A jauh lebih banyak dibandingkan dengan galur R. Gibberellin (GA₃) juga kadang digunakan untuk mempercepat pemanjangan malai-malai galur A agar ketika mekar tidak ada spikelet (bunga padi) yang masih tertinggal di dalam batang padi. Penyerbukan juga sering dibantu dengan menggoyang-goyangkan batang padi galur R) agar serbuk sarinya bisa sempurna beterbangan (rouging). Oleh karena di Cina hanya tempat-tempat di bagian selatan yang bisa ditanami padi secara terus menerus maka sebagian besar peneliti padi hibrida Cina menanamnya di Pulau Hainan (Cina bagian selatan, dekat Vietnam), dan mereka biasanya menunggu masa-masa kritis (masa pembungaan) tersebut dalam waktu 1 bulanan. Dari peneliti yunior sampai senior scientist akan bergabung di sana untuk mengawasi persilangan. Setelah proses penyerbukan selesai dan terlihat hasilnya bagus baru mereka pulang ke institusi masing-masing.

Two lines system menggunakan hanya dua galur saja, yakni A dan R. Galur A yang memiliki sifat sensitif terhadap lingkungan, sehingga sering disebut dengan Environment sensitive genic male sterility (EGMS). Galur EGMS ini juga terbagi ke dalam dua golongan, yakni photoperiod sensitive genic male sterile (PGMS) dan thermosensitive genic male sterile (TGMS). Pada sistem ini galur B tidak diperlukan lagi sehingga akan menghemat biaya produksi untuk menghasilkan benih-benih CMS. Prinsip kerja yang diadopsi adalah ketika suhu lingkungan melebihi ambang batas tanaman yang dimiliki TGMS, galur-galur tersebut akan memiliki serbuk sari yang steril (jantan mandul), namun ketika temperatur di bawah ambang batas maka tanaman akan fertil. Demikian pula pada tanaman dengan sifat PGMS, pada kondisi penyinaran yang melebihi ambang batas (biasanya terjadi pada musim panas) maka tanaman akan bersifat steril (jantan mandul terjadi), namun apabila panjang penyinaran lebih rendah dari ambang batas maka tanaman akan bersifat fertil.

Cina memiliki karakter dengan wilayah yang berbukit-bukit dan sebagian adalah padang pasir dan bersalju. Cina juga memiliki empat musim yang bisa mempengaruhi suhu udara dan panjang penyinaran. Penerapan sistem PGMS dan TGMS di Cina bisa dilakukan dengan mudah. Pada saat suhu rendah dengan waktu penyinaran pendek maka dilakukan perbanyakan benih CMS (galur A) sebanyak-banyaknya, dan pada saat suhu tinggi dan waktu penyinaran lebih panjang galur A tadi ditanam sebagai tanaman CMS yang akan diserbuki oleh galur restorer untuk menghasilkan benih F₁ hibrid. Pada PGMS titik kritis waktu penyinaran adalah 13,75-14 jam dengan intensitas pe-nyinaran di atas 50 Lux, sedangkan pada TGMS titik kritis suhu udara adalah 23-29^oC. Setiap galur/varietas biasanya memiliki titik kritis yang berbeda-beda, baik suhu dan waktu penyinaran. Biasanya tiap-tiap galur akan diuji coba untuk melihat galur mana yang sesuai dengan kondisi di daerah Cina. Untuk mendapatkan galur-galur PGMS dan TGMS mereka mengeksplorasi plasma nutfah yang dimiliki dan juga melakukan mutasi dengan radiasi sinar gamma. Galur TGMS telah berhasil dibuat di Jepang dengan penyinaran 20.000 rad sinar gamma. Galur tersebut dinamakan Reimei. Peneliti IRRI juga berhasil membuat TGMS mutan dari padi indica (IR32364-20-1-3-2) yang terlihat steril pada suhu 24-31^oC, namun sebagian fertil pada suhu 21-28^oC). Gen-gen yang mengatur PGMS dan TGMS juga telah diidentifikasi ternyata dikendalikan oleh gen inti, sehingga upaya transfer gen baik dengan persilangan atau rekayasa genetik bisa dilakukan.

Namun, PGMS dan TGMS memiliki kelemahan yakni apabila terjadi anomali iklim produksi benih F₁ hibrid menjadi terhambat atau gagal. Sebagai contoh misalnya pada saat pembungaan biasanya berlangsung pada saat musim panas, ternyata pada saat itu suhu justru turun masih di bawah ambang batas dan waktu penyinaran pendek (banyak awan dan hujan). Tanaman kemungkinan besar akan fertil atau sebagian steril. Benih F₁ yang dihasilkan menjadi tidak murni. Oleh karena itulah sistem dua galur memerlukan kajian yang mendalam. Bisa jadi tempat produksi benih galur A akan berbeda dengan produksi benih F₁ hibridnya. Produksi benih galur A dilakukan di daerah dengan suhu rendah dan waktu penyinaran pendek, sedangkan produksi F₁ hibridnya dilakukan di daerah yang memang suhu udaranya selalu tinggi (daerah tropis).

Selain PGMS dan TGMS sekarang juga dikembangkan galur anti PGMS dan anti TGMS. Artinya, berkebalikan dengan yang sebenarnya. Anti PGMS akan steril pada saat ditanam di daerah dengan waktu penyinaran pendek, dan fertil pada daerah dengan waktu penyinaran panjang. Demikian pula anti TGMS, akan bersifat steril pada saat suhu rendah dan bersifat fertil pada saat suhu tinggi. Dengan sifat seperti itu produksi benih F₁ hibrid bisa dilakukan di mana saja dengan kondisi cuaca apa saja. Hal ini akan memberikan peluang produksi benih padi F₁ hibrid sebanyak-banyaknya.

Teknologi ini merupakan terobosan teknologi untuk mengembangkan sayap perusahaan benih Cina di daerah tropis, seperti Indonesia, Malaysia, Thailand, dan lain-lain. Produksi galur A bisa dilakukan secara besar-besaran di Cina pada saat musim dingin atau di tempat yang memang selalu mengalami musim dingin (Cina bagina utara), sedangkan produksi benih hibridnya dilakukan setiap saat di daerah tropis yang suhu lingkungannya jauh melebihi ambang batas tanaman EGMS. Dengan teknik ini produksi benih tetap bisa dilakukan setiap tahun. Keberadaan galur CMS tetap aman karena hanya bisa diproduksi di Cina saja.

Super hybrid rice mengacu pada pengertian produksi padi yang dihasilkan dari benih padi hibrida adalah sangat tinggi melebihi yang sudah ada. Di Indonesia, padi inbreed yang sudah dilepas saat ini rata-rata produksinya sekitar 7-8 ton/ha GKG. Pada hibrida saat itu memiliki kemampuan (potensi hasil) 8-10 ton/ga GKG, bahkan ada yang mengklaim bisa menghasilkan 12-15 ton/ha GKG. Namun pada kenyataan produksi yang dihasilkan tidak sebesar itu.

Sampai periode tahun 2000-an produksi padi hibrida di Cina sudah mencapai 12 ton/ha. Maka lahirlah pemikiran untuk merakit padi hibrida super dengan target produksi minimal 15 ton/ha GKG. Berbagai pendekatan dilakukan untuk merakit padi hibrida seperti itu. Pada penelitian awal mereka telah berhasil mendapatkan kombinasi persilangan P64S/E32 dengan hasil sampai 17,1 ton/ha. Peneliti Cina melakukan perbaikan padi hibrida dengan pendekatan (i) perbaikan morfologi (ii) peningkatan level heterosis, dan (iii) bioteknologi. Pada perbaikan morfologi tanaman F₁ hibrid diarahkan memiliki bentuk daun yang seperti V, panjang, tegak, tipis, dan lebar. Daun yang tegak diharapkan bisa menyerap sinar matahari secara efisien. Ujung malai juga dipilih 60-70 cm dari tanah selama masa pengisian biji, lebih rendah dari yang biasanya. Ukuran malai juga harus lebih besar. Dengan berat butir isi per malai sekitar 5 g dan jumlah malai sekitar 300/m² maka secara teori potensi hasil adalah 15 ton/ha.

Perakitan padi hibrida super lainnya adalah dengan cara meningkatkan heterositas dengan menyilangkan varietas yang berjarak genetik jauh. Upaya ini sebetulnya sudah dilakukan pada saat periode I dan II, namun tentu saja pada program padi hibrida super ini dikombinasikan dengan bioteknologi. Berbagai gen-gen dari padi varietas liar dimasukkan ke dalam tetua padi hibrida untuk mendongkrak produksi. Gen-gen C₄ (dari tanaman Echinochloa crusgalli) untuk meningkatkan efisiensi fotosintesis juga dimasukkan melalui teknologi rekayasa genetika. Gen lain seperti Bt, cpc juga digunakan dalam program ini. MAS/MAB juga tak luput digunakan dalam program ini. Pada tahun 2001 penanaman secara luas padi hibrida super telah dilakukan dengan rata-rata hasil sekitar 13,5 ton/ha. Tahun-tahun berikutnya diharapkan akan lebih besar.

One line system, menggunakan pertimbangan bahwa F₁ hibrid yang sudah stabil dan bagus mestinya bisa diperbanyak tanpa mengurangi sifat heterosisnya. Secara teori banyak yang bisa dilakukan, yakni: propogasi secara aseksual (misal dengan ratoon atau membelah tanaman), kultur jaringan, menggunakan “balanced lethal system” (tanaman homosigot akan mati, yang heterosigot hidup), benih apomiksis (satu benih bisa banyak tanaman), genom amphidiploid (jumlah kromosom di duakalikan, sehingga sifat tanaman akan stabil walaupun genomnya terpisah saat terjadi meiosis). Di antara berbagai teknik tersebut benih apomiksis menjadi fokus penelitian. Pengembangan benih apomiksis ini sudah dilakukan peneliti Cina sekitar tahun 1980-an, dan sudah didapatkan beberapa galur yang bersifat poliembrionik. Namun, pengembangan secara komersial belum dilakukan karena mengalami kendala teknik. Gen-gen yang mengatur apomiksis tersebut bisa dipetakan dan marka yang diperoleh bisa digunakan sebagai alat seleksi.

Produksi Benih Hibrida Cina dan Indonesia

Bagaimanakah sistem produksi benih padi hibrida Cina? Produksi benih padi F₁ hibrid di Cina dilakukan oleh perusahaan benih swasta, sedangkan penelitian dilakukan oleh lembaga penelitian dan universitas. Penelitian padi hibrida Cina tidak dikontrol oleh satu lembaga, namun diserahkan kepada masing-masing universitas/lembaga penelitian. Tidak ada petunjuk teknis lembaga A meneliti padi hibrida dari aspek ini atau itu, namun sebagai pionir penelitian padi hibrida, institusi ini (China National Hybrid Rice Research Research and Development) selalu menjadi bahan rujukan, apalagi Prof. Yuan Longping masih memimpin lembaga ini. Masing-masing provinsi di Cina memiliki keunikan daerah tersendiri. Padi hibrida di satu provinsi belum tentu cocok untuk provinsi yang lain. Para peneliti padi hibrida Cina kadang melakukan pertemuan tapi hanya sebagai tempat berbagi pengalaman penelitian padi hibrida, bukan untuk mengatur pembagian topik penelitian padi hibrida. Setiap lembaga diberi kebebasan untuk menggali sumber daya/plasma nutfah padi yang ada. Perlu diingat bahwa Cina disinyalir sebagai tempat asal muasal padi, jadi ribuan jenis padi-padian ada di sini. Daerah Cina juga terdiri dari berbagai macam tipe iklim dari tropik sampai subtropik, sampai daerah bersalju pun punya. Berbagai macam tipe daerah ini menjadikan Cina mempunyai peluang mengembangkan padi hibrida untuk berbagai tipe iklim. Satu provinsi di Cina pun juga terdiri dari wilayah yang sangat luas dan beragam topografinya. Potensi pengembangan padi hibrida di Cina masih terbuka lebar.

Di antara sekian perusahaan benih yang ada di Cina, ada satu yang sangat menonjol yakni Yuan Long Ping High-Tech Agriculture Co, Ltd. Perusahaan ini merupakan BUMN yang sahamnya telah dijual bebas, namun kepemilikan mayoritas saham masih dikuasai oleh pemerintah Cina. Penggagas utama pendirian perusahaan ini adalah Prof. Yuan Longping. Perusahaan ini bahkan memiliki anak perusahaan sekitar 26 buah. Raksasa perusahaan benih ini juga telah merambah masuk ke Indonesia melalui perusahaan benih lokal tentunya. Mereka memasok benih ke Indonesia, disertai dengan pendampingan teknis. Atas kepintaran perusahaan benih Cina mempromosikan benih padi hibrida, hampir semua negara di Asia Tenggara telah memasukkan benih padi hibrida asal Cina ini sebagai salah satu pilihan benih padi hibrida. Setiap tahun Yuan Long Ping High-Tech Agriculture Co, Ltd membiayai ratusan peserta training padi hibrida di kota Changsa dari berbagai negara, termasuk dari Indonesia. Kadang pejabat-pejabat dari berbagai negara juga difasilitasi untuk melihat perkembangan padi hibrida Cina. Sebuah promosi yang cukup memakan biaya besar namun dipastikan akan kembali modal dalam beberapa tahun ke depan.

Tak bisa dipungkiri keuntungan luar biasa yang diperoleh dengan menjual benih menjadi daya tarik kenapa perusahaan lokal di Indonesia sangat antusias menjual padi hibrida. Harga benih padi hibrida per kilonya bisa mencapai 6-8 kali daripada benih inbreed. Menurut petunjuk teknis dari Diperta Jabar kebutuhan benih satu hektar sekitar 25 kg (padi sawah), dan 30 kg (padi gogo). Kalau 1 kg padi hibrida dihargai Rp 50.000, maka satu hektar akan memerlukan benih Rp 1.250.000-Rp 1.500.000. Seandainya benih hibrida terjual untuk lahan dengan luas 1 juta hektar, maka omzet perusahaan akan mencapai Rp 1.250.000.000.000-Rp 1.500.000.000.000 (1,2-1,5 triliun rupiah). Itu hanya untuk satu musim tanam saja. Seandainya terjual untuk dua musim tanam berarti omzet perusahaan bisa mencapai 2,4-3 triliunan rupiah per tahun untuk satu juta hektar. Menurut Biro Pusat Statistik Indonesia pada tahun 2009, luas panen padi sawah Indonesia sekitar 12,800,000 hektar. Berarti omzet padi hibrida untuk padi sawah di Indonesia maksimal sekitar 30,72-38,4 triliun rupiah per tahun. Jauh lebih menguntungkan dibandingkan mendatangkan benih-benih tanaman transgenik yang penuh kontroversial. Semuanya aman dan terkendali. Oleh karena itulah perusahaan lokal Indonesia mendatangkan benih dari luar negeri (terutama Cina), atau membeli lisensi pada lembaga penelitian di Indonesia, misalnya yang sudah terjadi pada BB Padi. Harga lisensi bisa mencapai USD10,000 (hampir 1 miliar rupiah). Kalau anda sebagai petani/peneliti independen, maka anda pun bisa menjual karya padi hibrida anda seharga itu. Nilai 1 miliar rupiah terlalu kecil bagi sebuah perusahaan benih swasta karena triliunan rupiah bakal kembali dalam waktu satu tahun.

Benarkah padi hibrida itu seindah yang dibayangkan? Ternyata masih banyak persoalan dibalik pengembangan padi hibrida. Dari beberapa laporan tertulis ataupun lisan (diperoleh selama kunjungan dinas), ada beberapa hal yang perlu dikaji ulang mengenai pertanaman padi hibrida di Indonesia, yakni:

1.  Harga yang masih terlalu mahal untuk ukuran petani Indonesia. Harga benih padi hibrida hanya cocok untuk sistem perusahaan besar, dengan lahan yang luas sekali. Memang benar saat ini benih padi hibrida digratiskan untuk petani lewat subsidi benih, namun seandainya subsidi dicabut petani akan kesulitan untuk membelinya.

2.  Benih F₁ hibrid tidak bisa disimpan untuk ditanam pada generasi berikutnya, sehingga petani tidak akan bisa mandiri. Ketergantungan benih akan semakin menyulitkan petani ketika dia akan menanam padi. Apabila petani berniat menanam benih inbreed dia akan kesulitan mencarinya karena saprodi akan lebih suka menjual benih padi hibrida karena keuntungan yang lebih besar. Kepunahan benih-benih padi inbreed bisa saja terjadi seandainya 100% lahan padi Indonesia ditanami padi hibrida.

3.  Berdasarkan pengujian lapang, tidak semua tempat bisa menghasilkan produksi tinggi sesuai yang dijanjikan/dipromosikan. Sama seperti padi inbreed memang tidak semua tempat memiliki persyaratan optimal untuk pertumbuhan. Oleh karena itulah diperlukan kajian lebih mendalam mengenai padi hibrida agar dapat direkomendasikan di daerah mana saja cocok untuk padi hibrida, agar pengharapan petani tidak terlampau tinggi.

4.  Tanaman F₁ hibrid umumnya adalah tanaman yang manja dan memerlukan input (pestisida dan pupuk) lebih banyak dibandingkan dengan tanaman inbreed. Analisis ekonomi perlu diperhitungkan juga apakah petani untung atau rugi ketika menanam padi hibrida.

Bagaimanakah padi hibrida di tingkat petani Cina? Sejak padi hibrida Cina dikomersialkan pada tahun 1976 (36 tahun yang lalu) telah ratusan jenis padi hibrida dihasilkan. Sampai tahun 2012 areal yang telah ditanami padi hibrida sudah mencapai 55-60% dari luas total pertanaman (di Indonesia masih kurang dari 5%). Pada awal pengenalan padi hibrida pemerintah Cina masih memberikan subsidi benih kepada petani (sama dengan di Indonesia saat ini). Seiring dengan waktu maka subsidi benih tersebut dicabut dan petani harus membayar mahal untuk benih padi hibrida. Sebagai perbandingan, saat ini benih 1 kg padi hibrida super sekitar 80 Yuan/kg (= Rp 104.000), benih padi hibrida biasa (bukan super) sekitar 40-50 Yuan/kg (=Rp 52.000-Rp 65.000), sedangkan harga benih padi inbreed sekitar 3-5 Yuan/kg (Rp 3.900-Rp 6.500). Kebutuhan benih di Cina adalah 15 kg/ha pada saat musim tanam 1 (awal musim panas), dan 25-30 kg/ha pada saat musim tanam II (akhir musim panas awal musim gugur/dingin). Petani memang harus merogok kocek cukup dalam untuk menanam padi hibrida. Namun, karena sudah puluhan tahun berpengalaman menanam padi hibrida mereka masih konsisten menanamnya, karena harga benih yang mahal akan tertutupi dengan hasil panen yang cukup tinggi.

Sebagai gambaran di Indonesia, misal panen padi biasa menghasilkan 7 ton/ha, padi hibrida super menghasilkan 15 ton/ha, dan harga 1 kg padi hasil panen (GKG) adalah Rp 4.500, maka penghasilan kotor petani padi hibrida Indonesia sebesar 15.000 kg x Rp 4.500 = Rp 67.500.000/ha per musim tanam. Harga benih yang harus ditebus (bila subsidi dicabut) adalah 25 kg x Rp 104.000 = Rp 2.600.000/ha. Kalau memakai benih biasa seharga 25 kg x Rp 5.000 = Rp 125.000/ha. Selisih harga benih yang harus ditebus adalah Rp 2.475.000. Memang cukup besar, namun biaya tersebut dapat ditutupi hanya dari kelebihan 1 ton hasil. Dengan perbaikan sistem pertanaman, mungkin kebutuhan benih bisa ditekan seminimal mungkin. Keuntungan menanam padi hibrida memang cukup menggiurkan, namun kadang kenyataan tidak selalu cocok dengan teori.

Melihat masih pro kontranya tanaman padi hibrida di kalangan petani, sebaiknya petani dibebaskan untuk memilih apakah dia akan menanam padi hibrida atau tidak. Petani biasanya sudah memiliki perhitungan tersendiri. Kalau dia merasa untung dengan menanam padi hibrida pasti dia akan terus menerus mencari benih padi hibrida, namun apabila baru menanam sekali sudah rugi pasti dia tidak akan menanam padi hibrida lagi. Semoga saja produsen benih juga menyadari tentang hal itu, yakni tetap memproduksi benih inbreed bersertifikat di samping benih padi hibrida sendiri.

Berdasarkan informasi yang diperoleh dari peneliti padi hibrida BB Padi, dari tahun 2002-2010 telah dilepas 67 varietas padi hibrida, jauh lebih banyak jumlahnya dibandingkan padi inbreed dalam rentang waktu yang sama. Tercatat ada 13 perusahaan benih swasta yang ikut bermain di dalam bisnis padi hibrida ini. BB Padi sendiri telah merilis 17 jenis. Tetua-tetua padi hibrida (umumnya CMS dan maintainer) didatangkan dari luar negeri, seperti IRRI, Jepang, India, dan Cina, dengan dominasi masih dipegang Cina. Untuk memenuhi kebutuhan benih hibrida di Indonesia sebagian besar masih diimpor (didatangkan langsung) dari luar negeri, dan mungkin hanya sebagian kecil saja yang dibuat di Indonesia. Benih padi hibrida ini juga telah dimasukkan ke dalam paket subsidi saprodi ke petani dengan harapan produksi beras dapat ditingkatkan sesuai dengan target pemerintah. Lewat bantuan benih (subsidi benih) inilah pemain-pemain padi hibrida swasta memasok benih padi hibrida. Subsidi pemerintah juga cukup besar, sekitar 2 triliunan rupiah untuk satu tahun anggaran. Maksud baik pemerintah ini semoga menjadi harapan yang nyata.

Sumber Bacaan

Anonim. 2005. Hybrid Rice and World Food Security (kumpulan makalah). Yuan Longping and Peng Jiming (eds.). China Science and Technology Press. 197 p..

Anonim. 2011. Proyek Padi Hibrida dan Nasib Petani. http://aktual.blogdetik. com/2011/01/08/proyek-padi-hibrida-dan-nasib-petani/

http://www.lpht.com.cn/eng/company/Company.htm (Profile of Long Ping Hi Tech Company)

Yuan Long-Ping and Fu, Xi-Qin. 1995. Technology of hybrid rice production. FAO. 84 pages.

Rekayasa Genetik Tanaman untuk Produksi Artemisinin, Senyawa Antimalaria

Rekayasa Genetik Tanaman

untuk Produksi Artemisinin, Senyawa

Antimalaria

Hasil penelitian rekayasa genetik untuk produksi artemisinin, senyawa

antimalaria, merupakan terobosan dalam memproduksi senyawa

tersebut secara massal dalam waktu yang relatif cepat.
Posted on December 2012, journal By Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor. 

Malaria merupakan penyakit yang sangat berbahaya dan 1,2% dari total kematian manusia disebabkan oleh penyakit ini. Wabah penyakit malaria di Indonesia makin meningkat. Di lain pihak, parasit malaria berupa Plasmodium falciparum telah resisten terhadap obat malaria yang biasa digunakan, sehingga perlu dikembangkan obat antimalaria yang baru. WHO telah merekomendasikan pengobatan penyakit malaria dengan Artemisia annua L. yang dikombinasikan dengan obat lain yang disebut Artemisinin Combination based Therapy (ACT), untuk mengatasi resistensi beberapa obat malaria. Artemisinin merupakan produk metabolit sekunder dari tanaman Artemisia. yang sangat efektif terhadap P. falciparum. Pembuatan artemisinin secara sintesis sulit dilakukan dan tidak ekonomis. Cara yang mudah dan murah adalah mengekstrak dari tanaman Artemisia. Sayangnya, tanaman Artemisia di Indonesia mengandung artemisinin yang rendah, sehingga tidak ekonomis untuk dikembangkan dalam skala industri. Metabolit sekunder dapat diproduksi dengan teknik kultur in vitro melalui kultur kalus atau kultur akar rambut. Pada kultur kalus, pemberian zat pengatur tumbuh (ZPT), baik auksin maupun sitokinin, sangat diperlukan. Penggunaan ZPT tersebut secara tunggal atau kombinasi dengan konsentrasi yang tepat diharapkan dapat menginduksi dan meningkatkan pertumbuhan kalus. Media kultur dan prekursor mempengaruhi produksi metabolit sekunder. Induksi akar rambut dapat dilakukan dengan menggunakan vektor Agrobacterium rhizogenes yang sesuai. Induksi akar rambut transgenik dihasilkan oleh adanya transfer T-DNA dari A. rhizogenes ke dalam sel tanaman. Fragmen TDNA yang ditransfer tersebut membawa gen rol untuk mensintesis auksin dan sitokinin, sehingga ekspresi gen tersebut menyebabkan terjadinya over produksi fitohormon dalam sel tanaman. Efisiensi transformasi dipengaruhi oleh:

(1) umur tanaman pada saat infeksi yang berkaitan dengan kompetensi sel,

(2) umur isolat Agrobacterium yang digunakan untuk infeksi yang berhubungan dengan virulensi. Dalam hal ini umur isolat bakteri berkaitan dengan fase pertumbuhan Agrobacterium,  sedangkan waktu inkubasi menentukan fase pertumbuhan yang berkaitan dengan proses molekuler dalam sel bakteri dalam mengatur gen rol pada proses transformasi,

dan

(3) suhu untuk pertumbuhan Agrobacterium.

Keuntungan dari kultur akar rambut antara lain adalah:

(1) dapat tumbuh pada media tanpa ZPT,

(2) pertumbuhan lebih cepat dibandingkan dengan akar yang berasal dari induksi ZPT, dan

(3) akar rambut dapat menghasilkan metabolit sekunder yang tinggi. Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa penggunaan metode kultur akar rambut dengan bantuan A. Rhizogenes pada tanaman ginseng meningkatkan kandungan total saponin 0,95% lebih tinggi dibandingkan dengan kandungan total saponin dari tanaman induknya. Di Balai Besar Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB-Biogen) telah dilakukan penelitian awal untuk produksi senyawa artemisinin, menggunakan metode kultur akar rambut dengan bantuan vektor A. rhizogenes. Tiga strain bakteri A. Rhizogenes telah dicobakan pada eksplan daun dan batang Artemisia. 

Pembentukan akar rambut pada eksplan daun Artemesia dengan menggunakan tiga strain bakteri A.rhizogenes. (a: strain

ATCC 15834, b: strain LBA 9457, c: Strain A4J).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa inokulasi A. rhizogenes pada daun Artemisia yang telah dilukai ternyata menginduksi pembentukan akar rambut. Bakteri A. Rhizogenes strain ATCC 15834 lebih cepat menginduksi akar rambut dibanding dua strain lainnya. Pembentukan akar rambut oleh strain ini mencapai 50,77% (Tabel 1). Hal ini disebabkan karena tanggapan jaringan berbeda terhadap strain bakteri yang digunakan. Kemampuan inokulasi Agrobacterium terhadap tanaman juga berbeda. Faktor yang menentukan kompetensi jaringan antara lain adalah spesies atau genotipe asal eksplan, jenis organ yang digunakan, dan tingkat perkembangan organ. Kompetensi tanaman berkaitan dengan senyawa fenolik yang dikeluarkan oleh sel tanaman yang luka. Senyawa tersebut berfungsi untuk mengaktifkan gen vir yang berperan dalam mengaktifkan gen rol. Gen rol diekspresikan pada jaringan tertentu, di mana kandungan sukrosa dan IAA tinggi. Eksplan daun kemungkinan banyak mengandung sukrosa dan IAA, sehingga gen rol dapat terekspresi dengan baik dan dapat menginduksi pembentukan akar rambut. Keberhasilan induksi akar rambut pada eksplan daun kemungkinan juga disebabkan oleh kompatibilitas Agrobacterium untuk menerima isyarat dari jaringan daun yang luka dan diikuti oleh terinduksinya gen vir yang diperlukan dalam proses inokulasi. Selain itu juga adanya kompatibilitas gen yang menyebabkan T-DNA A. rhizogenes kompatibel kompatibel dengan kromosom tanaman, sehingga T-DNA dapat terintegrasi dengan baik ke dalam genom tanaman. Hasil penelitian awal ini tampaknya merupakan terobosan dalam memproduksi senyawa artemisinin secara massal dalam waktu yang relatif cepat (BB-Biogen).

Sumber

Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor. Rekayasa Genetik Tanaman untuk Produksi Artemisinin, Senyawa Antimalaria. Hasil penelitian rekayasa genetik untuk produksi artemisinin, senyawa antimalaria, merupakan terobosan dalam memproduksi senyawa tersebut secara massal dalam waktu yang relatif cepat.

            http://pustaka.litbang.deptan.go.id/publikasi/wr296072.pdf

REKAYASA GENETIK DARI T-CELL UNTUK IMMUNOTERAPI MALIGNA HAEMATOLOGIKAL

REKAYASA GENETIK DARI T-CELL UNTUK IMMUNOTERAPI MALIGNA HAEMATOLOGIKAL

 Posted on Desember 2012, Journal by M. Casucci

Penelitian diterjemahkan oleh Kelompok 1

Jaringan lunak tumor maligna sub inguinal adalah pertumbuhan sel-sel yang baru (neoplasma) dalam jaringan lunak dimana perubahan sel (mitosis) tidak terkendali oleh tubuh dan berkembang biaknya sel jaringan di sekitarnya sambil merusak (destruktif) dapat menyebar ke bagian tubuh yang lain. Faktor penyebab tumor maligna jaringan lunak :

1. Faktor genetik atau keturunan dimana bisa diturunkan dari embrionik mesoderm.

2. Virus

Virus dapat dianggap bisa menyatukan diri dalam sel sehingga mengganggu generasi mendatang

dari populasi sel.

3. Agens fisik

 Pemajanan terhadap radiasi pengionisasi dapat terjadi saat prosedur radiografi berulang atau

ketiak terapi radiasi digunakan untuk mengobati penyakit.

4. Agens hormonal

Pertumbuhan tumor mungkin dipercepat dengan adanya gangguan dalam keseimbangan hormon baik dalam pembentukan hormon tubuh sendiri (endogenus) atau pemberian hormon eksogenus.

5. Kegagalan sistem immune

Kegagalan sistem immun untuk berespon dengan tepat terhadap sel-sel maligna memungkinkan tumor tumbuh sampai pada ukuran yang terlalu besar untuk diatasi oleh mekanisme immun normal.

6. Agens kimia

Kebanyakan zat kimia yang berbahaya menghasilkan efek-efek toksik dengan menggunakan struktur DNA pada bagian-bagian tubuh (zat warna amino aromatik, anilin, nikel, seng, polifinil chlorida)

Fisiologi

Tumor (pertumbuhan alami) pada umumnya tumor mulai tmbuh dari satu sel di suatu tempat (unisentrik) tetapi kadang tumor berasal dari beberapa sel dalam satu organ (multiokuler). Pada waktu bersamaan (sinkron) atau berbeda (metakron). Selama pertumbuhan tumor masih berbatas pada organ tempat asalnya maka tumor disebut dalam fase lokal. Tetapi kalau telah terjadi infiltrasi ke organ sekitarnya maka tumor telah mencapai fase lokal invasif atau infiltratif. Penyebaran lokal ini disebut penyebaran berkontinuitatum karena masih berhubungan langsung dengan tumor induknya.

Untuk mengukur kecepatan pertumbuhan tumor di pakai para meter “waktu ganda” yaitu waktu yang diperlakukan oleh tumor untuk mencapai volume menjadi dua kali semula. Makin pendek waktu ganda berarti makin cepat pertumbuhannya dan pada umumnya tumor tersebut makin ganas.

Patofisiologi

Tumor ganas merupakan proses yang biasanya makan waktu lama sekali, bermula ketika sel abnormal diubah oleh mutasi genetik dari DNA seluler. Sel abnormal ini membentuk klon dan mulai berfoliferasi secara abnormal, mengabaikan sinyal mengatur pertumbuhan dalam lingkungan sekitar sel tersebut kemudian dicapai suatu tahap dimana sel mendapatkan ciri-ciri invasif. Dan terjadi perubahan pada jaringan sekitarnya sel-sel tersebut menginfiltrasi jaringan sekitarnya dan memperoleh akses ke limfe dan pembuluh-pembuluh darah, melalui pembuluih darah tersebut sel-sel dapat terbawa ke area lain dalam tubuh untuk membentuk metastase. Penyebaran limfogen terjadi karena sel kanker menyusup ke saluran limfe kemudian ikut aliran limfe menyebar dan menimbulkan metastasis di kelenjar limfe regional.

Pada umumnya kanker mula-mula menyebar dengan cara ini baru kemudian menyebar hematogen, pada permulaan penyebaran hanya terjadi pada satu kelenjar limfe saja tetapi selanjutnya terjadi pada kelenjar limfe regional lainnya. Setelah menginfiltrasi kelenjar limfe sel kanker dapat menembus dinding struktur sekitar menimbulkan perlekatan. Kelenjar limfe satu dengan yang lain sehingga membentuk paket kelenjar limfe. Penyebaran hematogen terjadi akibat sel kanker menyusup ke kapiler darah kemudian masuk ke pembuluh darah dan menyebar mengikuti aliran darah vena sampai organ lain.

Manifestasi klinik

Keluhan biasanya tidak ada, kecuali bila sudah membesar dan menekan / tarikan saraf atau obat. Benjolan tanpa nyeri, tanpa radang, kapsul ada, batas jelas. Tumor kecil sukar dibedakan dengan yang jinak. Tumor besar ; infiltrasi sekitar, hipervaskulerisasi, pada perabaan hangat, ada metastasis regional / jauh.

Sistem kekebalan tubuh adalah pertahanan alami dari suatu organisme terhadap pathogen. Perlindungan yang diberikan oleh kerjasama dari sel-sel sistem imun secara adaptif yang dapat dengan cepat menghilangkan pathogen dengan spesifitas tinggi. Penelitian tentang tumor menjadi penanganan yang lebih kompleks. Eksperimen pada model hewan percobaan memiliki strategi yang berbeda aktif, pengobatan dengan imunoterapi T-sel telah menghasilkan hasil yang paling menjanjikan. Bukti yang paling meyakinkan kemanjuran T-limfosit  melawan kanker adalah graft-versus leukemia (GvL) efek yang diamati dalam konteks tranplantasi sel haematopoietic alogenik (allo-HCT).  Pengaturan autologous, pengembangan secara ex vivo isolasi tumor dengan reaktif T-cell dari pasien melanoma menghasilkan keberhasilan dari terapi T-cell. Meskipun hasil ini mengalami eksploitasi alami yang timbul dari peningkatan tumor T-cell untuk mengobati kanker adalah terbatas oleh beberapa factor intrinsic. Pengaturan allogeneic, efek GvL sering terjadi dari (GvHD), karena berhubungan dengan jaringan host sehat dari alloreactive T-cell.  Sebaliknya dalam pengaturan autologous, keberhasilan adopsi T-cell melanoma belum pernah diterjemahkan ke jenis kanker yang lain, mungkin karena kesulitan dalam mengisolasi dan memperluas tumor-reaktif sel-T dari tumor imunogenik.

Kemajuan yang signifikan pada teknologi transfer-gene yang telah dikembangkan dalam dekade terakhir  menawarkan alat-alat baru untuk menjalankan sel-T alami. Limfosit dapat dimodifikasi secara genetik untuk menghasilkan ‘supranatutal’ tumor-reaktif sel-T dalam jumlah besar dari hampir semua pasien kanker. Kemampuan ‘supranatural’ T-cell mungkin mengekspresikan reseptor klonal yang menyedikakan spesifikasi yang baru, faktor –factor pelaksanaan T-cell yang terus meningkat atau faktor - faktor keamanan memungkinkan pembersihan mereka pada kasus toksisitas. Masing - masing aplikasi tersebut akan didiskusikan pada sesi berikutnya, dengan khusus fokus pada pengobatan  haematological malignancies.

Modifikasi genetic untuk menentukan spesifikasi tumor

Antigen kanker seringkali bersifat self-antigen dan kanker T-cell tertentu, dengan demikian subjek toleran terhadap mekanisme selektif puat dan peripheral, mampu untuk menjinakkan frekuansi dan rektifitas tumor dalam menghindari autoimunitas yang mengganggu. Oleh karena itu, adopsi imunoterapi dengan autologous tumor limfosit tertentu dibatasi oleh kesulitan dalam mengisolasi dan mengembangan tumor spesifik sel-T dengan pencapaian yang tinggi dari pasien kanker.  Untuk mengatasi keterbatasan ini, Limfosit T dapat diarahkan terhadap tumor melalui genetic transfer of high-avidity clonal T-cell receptors (TCRs) atau chimeric antigen receptors (CARs) khusus untuk tumor yang  berasosiasi dengan antigen (TAAs).

Reseptor T-cell (TCRs) dan chrimeric reseptor antigen. (A) TCR adalah  sebuah molekul heterodimer yang terdiri dari dua rantai polipeptida ( α dan β) transmembran, bersifat kovalen disulfide yang dihubungkan oleh obligasi. Domain yang variable menyediakan kekhususan rantai α dan β, sementara asosiasi dengan rantai CD3 ζ, δ, ϵ, memiliki fungsi untuk aktivasi efektor dan menghasilkan TCR kompleks. Beberapa strategi seperti, pemurnian TCR, optimasi kodon dan penambahan pasang C untuk meningkatkan ekspresi dari eksogen TCR pada permukaan sel sementara menghilangkan kesalahan pasangan dengan endogen TCR rantai α dan β. (B) CAR dibangun oleh domain intraseluler kompleks dengan daerah variable rantai berat dan ringan (masing-masing VH dan VL) yang merupakan sebuah antibody monoclonal yang menghasilkan spesifitas antigen. Generasi pertama CARs hanya terdapat signal T-cell domain di mana transmit untuk aktivasi signal, rantai CD3  ζ (kiri). Generasi kedua CARs memasukkan juga satu costimulatory domain, seperti CD28 atau 41BB, yang meningkatkan T-cell ekspansi dan pelepasan sitokin. Generasi ketiga, menggabungkan dua domain costimulatory, seperti CD28 dan 41BB yang lebih meningkatkan kelangsungan hidup T-cell secara in vivo.

Perbandingan transfer gen melalui pendekatan TCR dan CAR

Limfosit T sebagai Efektor Anti Tumor

Subpopulasi limfosit T, limfosit T-helper dan T-sitotoksik sama-sama berperan dalam mengeliminasi antigen tumor. Sel yang mengandung antigen tumor akan mengekspresikan antigennya bersama molekul MHC kelas I yang kemudian membentuk komplek melalui TCR (T-cell Receptor) dari sel T CD8⁺, selanjutnya mengaktivasi sel T-sitotoksik untuk menghancurkan sel tumor tersebut. Sebagian kecil dari sel tumor juga mengekspresikan antigen tumor bersama molekul MHC kelas II, sehingga dapat dikenali dan membentuk komplek dengan sel T CD4⁺ dan mengaktivasi sel T-helper terutama ThI untuk mensekresi 1FN_ƴ dan TNFα dimana keduanya akan merangsang sel tumor untuk lebih banyak lagi sitoksisitas dari sel TCD^+5,28.

Sumber:

Brunner and Suddarth. 2002. Keperawatan Medikal Bedah, edisi 8. EGC : Jakarta.

C.J.H Van de Velde, dkk. 1999. Onkologi, edisi kelima direvisi. Yogyakarta.

Genetic engineering of T cells for the immunotherapy of haematological malignancies. M. Casucci, A. Bondanza, L. Falcone, E. Provasi, Z. Magnani & C. Bonini Experimental Haematology Laboratory, PIBIC, Division of Regenerative Medicine, Stem Cell and Gene Therapy, S. Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy

R. Sjamsuhidajat, dkk. 1998. Buku Ajar Ilmu Bedah, edisi revisi. EGC. Jakarta.

http://eprints.undip.ac.id/29134/3/Bab_2.pdf